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（四）實體腫瘤學

技術原理是根據核酸堿基互補配對原則，同源的DNA-DNA ，DNA-RNA和RNA-RNA兩條核酸單鏈 ，在一定條件下結合成雙鏈 。熒光素直接標記的核酸探針及待測DNA ，經變性後雙鏈打開 ，兩者混合雜交 ，互補形成雜交體 ，最後通過熒光顯微鏡進行觀察 ，從而實現對目標核酸的定性 、定量和相對定位分析 。

圖1 ：FISH的實驗流程示意圖

在體外診斷中 ，H&E染色可以顯現細胞的基本結構 ，免疫組化（IHC）可以揭露某個特定分子在組織中的分布 ，而FISH ，則可以更進一步揭示更為微觀的變化 ，如病原體 、染色體異常等 。

FISH探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法 。直接標記是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸共價結合 ，而間接標記是用生物素標記再通過熒光素親和素來進行檢測 。這兩者的核心區別則是直接標記法無法將熒光信號放大 ，因而其靈敏度不如間接標記法且無法檢測長片段 。

圖3 ：隨機引物法製備DNA探針原理示意圖

第二種DNA探針製作方法則是隨機引物法（圖3） 。這種方法是使用寡核苷酸引物和大腸杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段來標記DNA片段 。這種方法可代替缺口平移產生均一的標記探針外 ，還在許多方麵優於缺口平移法 ，比如標記核苷酸在DNA探針中的摻入率可達50％以上 ，因此使用少量DNA也可以進行有效標記 。相比於切口平移法，隨機引物法可以用於更小的DNA片段 。

RNA探針製備最常用的則是體外轉錄法 。進行體外轉錄時 ，先將靶核苷酸序列克隆到含噬菌體轉錄啟動子的載體中 ，然後在RNA聚合酶的作用下 ，以DNA為模板 ，以含有標記的三磷酸苷為原料 ，對啟動子下遊的序列進行轉錄 ，而啟動子本身並不被轉錄 。體外轉錄常用噬菌體轉錄啟動子 ，如沙門氏菌噬菌體和大腸杆菌噬菌體T3 、T7 。

體外轉錄為RNA

在整個過程中 ，除卻聚合酶濃度 、核酸純化程度是反應的關鍵因素外 ，所使用的熒光素質量也會影響最終的結果呈現 。

Sigma-Aldrich（現默克生命科學下屬的子品牌 ，以下簡稱sigma）的Atto染料係列 ，化學結構穩定 、熒光效率高 、易和核酸或者抗體分子結合 ，並且可實現出色熒光成像效果 。

Atto染料顯現出比羰花青染料或大部分細胞和生物分子固有的自發熒光更長的熒光信號壽命 (0.6-3.8 ns) 。

可降低樣品、溶劑 、玻璃或聚合物支架的自發熒光 。

Atto染料對壽命較短的熒光基團的幹擾較小 ，提高了生物分析和成像技術的整體靈敏度 。

tto染料可將探針和生物分子綴合進行多重檢測 。選擇發射信號分開的兩種Atto染料可支持單個實驗的多個激發和測量結果 。

另外 ，針對探針製備 ，Sigma還提供經由Atto 488標記的dUTP ，其特殊的分子結構可以有效避免探針製備時產生的二聚體從而弱化雜交結果 。