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1. 什麽是親和素-生物素係統

（鏈黴）親和素-生物素是免疫檢測中常用的信號放大係統 。親和素是蛋清中常見的糖類蛋白 ，由四個相同的亞基組成。每一個亞基都包含一個生物素結合位點 ，因此一個理論上正常的親和素能夠結合4個生物素 。親和素與生物素具有非常強烈的親和力 ，其解離常數大約是1.3*10-15M ，是已知自然界中最強的非共價相互作用之一 。親和素的蛋白質結構非常穩定 ，即使在濃度高達8M的尿素溶液中 ，也能夠維持結構的完整性 ，保持對生物素的親和力 。並且在結合生物素後 ，親和素-生物素結構的穩定性進一步增強 ，研究表明 ，即使在濃度為8M的鹽酸胍中，親和素-生物素複合物依然能夠穩定存在 。另外 ，親和素-生物素的結合與抗體-抗原的結合類似 ，有極高的特異性 ，能夠在複雜的溶液環境中相互結合 ，因此 ，親和素-生物素係統廣泛應用在免疫檢測中 。其中應用最為廣泛的方式是將親和素包被在磁珠表麵 ，生物素標記抗體 。

△生物素磁珠 ，生物素化抗體免疫檢測示意圖

2. 親和素 ，鏈黴親和素 ，以及中性親和素

親和素蛋白是堿性糖蛋白 ，分子量約為67kDa ，蛋白質等電點約為10 。由於蛋白質等電點較高 ，在pH中性條件下 ，親和素帶正電 。並且親和素存在寡糖成分（主要由甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖組成的異質結構） ，容易與細胞表麵 、核酸 、凝集素等物質產生非特異性結合 ，造成本底過高的問題 。鏈黴親和素是由鏈黴菌中表達純化出的蛋白 ，與親和素類似 ，鏈黴親和素也由四聚體組成 ，每個單體都可以以極高的親和力結合一個生物素 。不同的是 ，鏈黴親和素沒有糖鏈 ，分子量比親和素略低 ，大約為53kDa ，蛋白質等電點在6.8~7.5之間 ，非特異性吸附也比親和素要小很多 。

另外一種廣泛使用的親和素是中性親和素（NeutrAvidin） 。中性親和素實際是去除糖鏈後的親和素 ，分子量約為60kDa ，蛋白質等電點為6.3 。由於去除了糖鏈 ，中性親和素的非特性得到了極大的降低 ，同時又保留了親和素對生物素極高的親和力 。

△幾種親和素的性質對比

3. 生物素及其衍生物結構

生物素又被稱為維生素H ，或者維生素B7 ，是一種水溶性維生素 ，其功能是在人體內參與脂肪 、糖 、蛋白代謝等重要物質的生化反應 。生物素廣泛存在與動物肝 、腎 、酵母 、牛乳中。

△生物素分子結構圖

生物素分子量約為244 ，能夠以共價鍵的形式 ，標記在抗體蛋白的表麵 ，而不影響蛋白質的生物活性 。因此廣泛應用於蛋白標記 ，進而通過親和素-生物素係統對標記蛋白進行分離 、富集 、檢測 。

如今通過不同的改造方式 ，生物素有各種各樣的衍生物 ，生物素標記蛋白的技術也日趨成熟 。生物素衍生物結構基本上由生物素雙環結構 ，戊酸側鏈 ，間隔臂 ，以及反應基團組成 。其中間隔臂的親疏水性 ，長度對於蛋白的標記效率 ，標記後生物素與親和素後續反應性有重要影響 。如鏈黴親和素與生物素結合位點是一個口袋型結構 ，深度大約有0.9納米 。因此 ，生物素的間隔臂長度 ，直接影響到標記在蛋白表麵的生物素是否能夠進入親和素反應口袋中 。在某些應用中 ，長間隔臂的生物素具有更高的分析靈敏度 。

△生物素衍生物結構示意圖

△常用生物素臂長及分子量

4. 生物素幹擾

生物幹擾是親和素-生物素係統檢測中普遍存在的問題 。采用親和素-生物素係統進行免疫檢測時 ，如果待測樣本中存如果存在高濃度的遊離生物素 ，將與生物素化抗體競爭結合親和素的結合位點 ，進而影響檢測結果 。

作為水溶性B族維生素 ，生物素在人體內主要經過腎髒代謝 。正常人體血液中生物素濃度範圍大約在0.28~0.55ng/mL ，遠低於各類免疫檢測試劑盒中聲稱的產生幹擾的生物素濃度 。但是日常補充生物素的人群不在少數 ，根據一項統計數據 ，美國大約有15％的人群日常補充生物素 。而一篇發表在ClinicalChemistry上的研究文獻顯示 ，正常人在口服100mg生物素後1.5小時，血液中生物素濃度達到峰值 ，平均為762.52ng/mL ，24小時後 ，濃度下降至平均71.59ng/mL ，高於許多檢測試劑盒聲稱的生物素幹擾濃度下限 。而且依據不同的生物素攝入量 ，以及不同檢測試劑的性能 ，口服生物素後對檢測的幹擾可能持續至48小時 。

△各大係統受生物素幹擾統計分析 。（注 ，為美國FDA注冊項目）

由於基本上不采用生物素親和素係統 ，雅培的免疫檢測試劑一直以無生物素幹擾作為賣點之一 。實際上在2011年注冊的維生素D檢測試劑中 ，雅培采用了生物素標記的維生素D作為競爭衍生物，與鼠抗生物素抗體標記的吖啶酯作為標記物進行檢測 ，因此也會在一定程度上受到生物素幹擾 。

5. 抗生物素幹擾的方法

理論上所有采用親和素-生物素係統的檢測試劑盒都會受到生物素幹擾 。目前有幾種方法可以降低生物素幹擾 ，或者提高試劑對生物素幹擾的耐受性 。

最簡單直接的方法是提高親和素的加入量 ，如加大親和素磁珠的濃度 ，以提高反應體係對生物素的載量 ，但是這種做法通常會增加試劑的成本 ，而且改善的程度有限 。另外一種有效的方法是提前將親和素組分和生物素化組分提前預混 ，讓親和素先與生物素化抗體反應 ，進而減少樣本中遊離生物素對反應的幹擾 。診斷試劑盒一般是采用鏈黴親和素磁珠-生物素反應體係 ，因此在解決生物素幹擾的問題上 ，各大公司一直在創新進步 ，希望能夠從技術上徹底解決這一問題 。例如 ，近日公布的一項專利顯示 ，某一公司診斷開發出一種抗生物素幹擾的抗體 ，能夠特異性結合遊離生物素 ，而對標記在抗體表麵的生物素不結合 ，因此可以作為抗幹擾組分添加至反應體係中 ，通過結合樣本中遊離的生物素而減少幹擾 。另外一種方法是采用抗生物素抗體替代親和素類蛋白 。如美國一家初創公司就開發出了特定的抗生物素抗體 ，其對生物素的親和力與親和素類蛋白相當 ，但是與遊離生物素的親和力則要低100萬倍 。

-總結-

雖然生物素幹擾一直存在 ，也尚未得到完全解決 。但是眾多廠家依然在化學發光免疫檢測中使用（鏈黴）親和素-生物素係統 ，一個原因是早期開發過程中采用了此類模式 ，如果擯棄或改變這種模式 ，無異於重新開發試劑 ，調整儀器係統 ，並且需要重新進行注冊申報 ，需要花費大量的人力物力 ，以及消耗非常長的時間 。另一個原因是采用這種模式能夠簡化試劑開發生產流程 ，並且在一定程度上降低試劑成本 。不管出於何種原因 ，（鏈黴）親和素-生物素係統依然廣泛應用於免疫檢測中 ，但是生物素幹擾是一個不容忽視的問題 。

參考文獻 ：略